Хроматография – заттарды бөлу әдістерінің бірі. Ол микробөлшектердің физикалық және химиялық қасиеттерін кейінгі сапалық және сандық талдау үшін қолданылады. Бұл технологияның нұсқасы жақындық хроматографиясы болып табылады. Молекулярлық жақындық қасиетін пайдалана отырып, ақуыз қосылыстарын дифференциациялау идеясы ғылымда бірнеше ондаған жылдар бойы белгілі болды. Бірақ ол өзінің дамуын соңғы жылдары, матрица ретінде пайдаланылатын жоғары кеуекті гидрофильді материалдарды енгізгеннен кейін ғана алды. Бұл әдіс аналитикалық есептерді де (заттарды бөлу және олардың идентификациясы) және препараттық есептерді (тазарту, концентрация) шешуге мүмкіндік береді.
Эссенция
Афинділік хроматографиясы (латынның affinis – «іргелес», «байланысты» деген сөзінен шыққан) аралық молекула (лиганд немесе аффинант) мен нысана молекула арасындағы жоғары спецификалық байланыстардың түзілуі болып табылатын аффинді әрекеттесулерге негізделген. Бұл механизмдер табиғатта кең таралған (медиаторлардың немесе гормондар мен рецепторлардың, антиденелердің жәнеантигендер, полинуклеотидтердің гибридизациясы және басқа да процестер түрлері). Медицинада жақындық хроматографиясы 1951 жылдан бері практикалық мақсатта қолданылып келеді
Компоненттер келесідей бөлінген:
- бөлінетін заты бар жұмыс ерітіндісі сорбент арқылы өтеді;
- сорбент матрицасында тұндырылған лиганд бұл затты сақтайды;
- ол шоғырланған (жинақтау);
- еріткішпен жуу арқылы сорбенттен оқшауланған затты алу.
Бұл әдіс бүкіл ұяшықтарды оқшаулауға мүмкіндік береді. Дәстүрлі сорбциялық хроматографиядан ерекшелігі, жоғары селективтілігімен сипатталатын, оқшауланған компоненттің сорбентпен күшті биоспецификалық байланысы бар.
Адсорбенттер
Адсорбенттер ретінде келесі заттар қолданылады:
- Агардан алынған полисахарид, агароза негізіндегі гель қосылыстары. Ең жиі қолданылатын 3 сорт: сефароза 4В, CL (кросс-байланыстырылған агароза) және аффи-гель. Соңғы құрамы агароза мен полиакриламидтің модификацияланған гелі болып табылады. Оның биологиялық инерттілігі жоғары, химиялық және термиялық төзімділігі жоғары.
- Кремний диоксиді (силикагель).
- Шыны.
- Органикалық полимерлер.
Лигандтармен жанасу кезінде механикалық кедергілерді жою үшін оны тасымалдаушыдан бөлу үшін қосымша заттар қолданылады (пептидтер, диаминдер, полиаминдер, олигосахаридтер).
Жабдық
Афинитті хроматография жабдығы келесі негізгі блоктарды қамтиды:
- жылжымалы фазаға арналған резервуарлар (элюент);
- орташа қоректендіруге арналған жоғары қысымды сорғылар (көбінесе поршеньді);
- элюенттерді шаңнан тазалауға арналған сүзгі;
- мөлшерлеу құрылғысы;
- қоспаларды бөлуге арналған хроматографиялық баған;
- бағаннан шығатын бөлінген құрамдастарды анықтауға арналған детектор;
- хроматограмма жазу құрылғылары және микропроцессорлық блок (компьютер).
Еріген ауаның мөлшерін азайту үшін гелий алдымен жылжымалы фазадан өтеді. Элюент концентрациясын өзгерту үшін бағдарламашы басқаратын бірнеше сорғылар орнатылады. Хроматографиялық бағаналар тот баспайтын болаттан (коррозияға төзімділіктің жоғарылауы үшін), шыныдан (әмбебап опция) немесе акрилден жасалған. Дайындау мақсатында олардың диаметрі 2-ден 70 см-ге дейін өзгеруі мүмкін. Аналитикалық хроматографияда Ø10-150 мкм микробағандар қолданылады.
Детекторлардың сезімталдығын арттыру үшін қоспаға реагенттер енгізіледі, олар спектрдің ультракүлгін немесе көрінетін аймағында көбірек сәулелерді сіңіретін заттардың түзілуіне ықпал етеді.
Әдістеме
Сұйық ұқсастық хроматографиясының 2 негізгі түрі бар:
- Баған стационарлық фазамен толтырылған және ол арқылы қоспа ағынмен өтетін бағанэлюент. Бөлу қысымда немесе ауырлық астында болуы мүмкін.
- Жұқа қабат. Элюент капиллярлық күштердің әсерінен жазық адсорбент қабаты бойымен қозғалады. Адсорбент шыны табаққа, керамикалық немесе кварц таяқшасына, металл фольгаға қолданылады.
Жұмыстың негізгі кезеңдері мыналарды қамтиды:
- адсорбентті дайындау, лигандты тасымалдаушыға бекіту;
- айырғыш қоспаны хроматографиялық бағанға беру;
- жылжымалы фазалық жүктеу, компонентті лиганд арқылы байланыстыру;
- байланысқан затты оқшаулау үшін фазаны ауыстыру.
Баратын жер
Афинділік хроматографиясы келесі заттардың түрлерін бөліп алу үшін қолданылады (пайдаланылатын лиганд түрі жақшада көрсетілген):
- ферменттік тежегіштердің, субстраттардың және кофакторлардың (ферменттердің) аналогтары;
- генетикалық жаттық белгілері бар биоорганикалық заттар, вирустар және жасушалар (антиденелер);
- жоғары молекулалық көмірсулар, моносахаридті полимерлер, гликопротеиндер (лектиндер);
- ядролық ақуыздар, нуклеотидилтрансферазалар (нуклеин қышқылдары);
- рецепторлар, тасымалдау ақуыздары (дәрумендер, гормондар);
- жасуша мембраналарымен (жасушалармен) әрекеттесетін ақуыздар.
Бұл технология иммобилизацияланған ферменттерді алу үшін де қолданылады және оларды целлюлозамен байланыстыру иммуносорбенттерді өндіруге мүмкіндік береді.
ДНҚ байланыстыратын ақуыздардың хроматографиясы
ДНҚ-байланыстырушы белоктарды оқшаулау көмегімен орындаладыгепарин. Бұл гликозаминогликан молекулалардың кең ауқымын байланыстыруға қабілетті. Осы топтағы белоктардың ұқсастық хроматографиясы мына сияқты заттарды бөліп алу үшін қолданылады:
- инициация және трансляцияның ұзару факторлары (нуклеин қышқылының молекулалары мен белоктарының синтезі);
- рестриктазалар (қос тізбекті ДНҚ-дағы белгілі бір тізбектерді танитын ферменттер);
- ДНҚ лигазалары мен полимеразалары (жаңа химиялық байланыс түзу үшін екі молекуланың қосылуын катализдейтін және ДНҚ репликациясына қатысатын ферменттер);
- иммундық және қабыну процестерінде маңызды рөл атқаратын серин протеаза ингибиторлары;
- өсу факторлары: фибробласт, Шванн, эндотелий;
- клеткадан тыс матрицаның белоктары;
- гормондық рецепторлар;
- липопротеиндер.
Қадір
Бұл әдіс реактивті қосылыстарды (ферменттер және үлкенірек агрегаттар - вирустар) оқшаулаудың ең ерекше әдістерінің бірі болып табылады. Бірақ ол биологиялық белсенді заттарды бөліп алу үшін ғана қолданылмайды.
Антиденелерді аз мөлшерде анықтау, полиаденил қышқылын сандық бағалау, дегидрогеназалардың молекулалық массасын жылдам анықтау, кейбір ластаушы заттарды жою, трипсиннің белсенді емес түрінің активтену кинетикасын, адамның молекулалық құрылымын зерттеу. интерферондар - бұл аффинділік қолданылатын зерттеулердің толық тізімі емес хроматография. Клиникада қолданылуы оның мынадай артықшылықтарына байланысты:
- Тиімді тазалау мүмкіндігібелоктар, полисахаридтер, нуклеин қышқылдары. Олар физикалық және химиялық қасиеттері бойынша аздап ерекшеленеді және гидролиз, денатурация және басқа әдістерде қолданылатын өңдеудің басқа түрлері кезінде белсенділігін жоғалтады.
- Заттардың бөліну жылдамдығы, процестің динамикалық сипаты.
- Диссоциация константаларын анықтау үшін арнайы ферментті тазарту және изофермент гомогенизациясы қажет емес.
- Заттардың кең ауқымын ажырата алады.
- Лигандтарды аз тұтыну.
- Үлкен көлемдегі заттардың бөліну мүмкіндігі.
- Биологиялық макромолекулаларды байланыстырудың қайтымды процесі.
Бұл әдісті басқалармен біріктіріп, қосымша өрісті (гравитациялық, электромагниттік) енгізуге болады. Бұл хроматографияның техникалық мүмкіндіктерін кеңейтуге мүмкіндік береді.
Ферменттік инженерия
Осы әдістің арқасында биотехнологияның жаңа саласы – ферменттік инженерия белсенді түрде дами бастады.
Ферменттерді оқшаулауға арналған ұқсастық хроматографиясының келесі артықшылықтары бар:
- аз уақыттың нәтижесінде ферменттерді көп мөлшерде алу, нәтижесінде - олардың бағасының төмендеуі;
- ферменттерді иммобилизациялау олардың медицина мен өнеркәсіпте қолдану аясын айтарлықтай кеңейте алады;
- Ферменттердің ерімейтін қатты тірекпен байланысы табиғи және физиологиялық процестерде маңызды рөл атқаратын микроортаның әсерін және реакциялардың бағытын зерттеуге мүмкіндік береді.
