ПТР немесе полимеразды тізбекті реакция - медицинада және басқа да ғылыми салаларда кеңінен қолданылатын күрделі зертханалық әдіс. ПТР диагностикасы бір уақытта ғылымдағы нағыз серпіліс болды.
Сипаттамасы
Сандық ПТР – нақты уақыттағы ПТР түрі.
Бұл ПТР нұсқасы ретінде түсініледі, онда реакция кинетикасы үнемі тіркеледі, бұл күрделі молекулалық қоспадағы нақты ДНҚ нуклеотидтер тізбегінің мазмұнын сапалы бағалауға мүмкіндік береді.
Сандық ПТР әдісі төменде толығырақ талқыланады.
Талдаудың мәні
Инфекцияларды диагностикалау үшін мәдени және серологиялық әдістер әсіресе жиі қолданылады. Біріншісі бойынша қан сарысуындағы инфекциялық қоздырғышқа қарсы антиденелер анықталады. Екіншісінде ауру адамнан алынған биологиялық материал қоздырғыш колонияларының өсуіне қолайлы белгілі бір ортаны себу үшін пайдаланылады. Екеуінде де диагностикаіс күндер немесе апталарға созылуы мүмкін.
ПТР зерттеу науқас адамнан алынған әртүрлі биологиялық материалдармен жүргізілуі мүмкін. Қан және басқа патологиялық, физиологиялық және биологиялық орталар мен сұйықтықтар үлгілер ретінде әрекет етеді. Сіз нәжіс немесе зәрді ПТР жасай аласыз.
Атипті және вирустық инфекциялар көбінесе сандық ПТР арқылы диагноз қойылады, өйткені олар тудырған патологиялық процестің ерекше сипатына байланысты оларды анықтау оңай болмауы мүмкін. Мұндай инфекцияларды анықтау үшін уақыт қажет, оның барысында организмде серологиялық әдістермен анықталған антиденелер өндіріле бастайды. Бірақ бұл кейбір жағдайларда қабылданбайды.
Орындау әдісі
ПТР әдісі - науқастан бөлінген үлгілерде инфекцияны зертханалық анықтау (in vitro).
Полимеразды тізбекті реакцияны жүргізу үшін арнайы реагенттер жинағы қажет.
Сынақ материалы реагенттері бар пробиркаларға енгізіледі. Пробиркалар арнайы аппаратқа – қажетті РНҚ немесе ДНҚ фрагменттерін күшейтуге (санын көбейтуге) арналған ПТР күшейткішіне орналастырылады, ПТР күшейткіші циклдік режимде жұмыс істейді. Кез келген циклде үлгілерде қоздырғыштың РНҚ немесе ДНҚ тізбегі болса, онда ерітіндіде осы нуклеин қышқылдарының бөлшектерінің көбірек көшірмелері жинақталады. Қоздырғыштың бар-жоғын және оның үлгілердегі мөлшерін анықтауға болады.
ПТР түрлері
ПТР арқылы сапалы талдау келесі нәтижені алуға мүмкіндік береді:
- үлгілерде қызығушылық тудыратын қоздырғыш табылмағанда теріс;
- оң, егер үлгілерде белгілі бір патогенге тән тізбектер табылса.
ПТР оң нәтижесімен диагноз қойылған инфекцияның болуы туралы 95% дәлдікпен айтуға болады. Сонымен қатар диагностикалық мақсатта қолданылатын ПТР жинақтарының дәлдігі 100%-ға жетеді.
Әдетте қате нәтижелердің 5% адам факторымен анықталады. Мысалы, реагенттерді талдау және сақтау техникасын бұзу зерттеудің дәлдігін айтарлықтай төмендетуі мүмкін.
Сандық ПТР вирустық жүктеме түсінігін анықтайды. Науқастан алынған үлгілерде патогендік ДНҚ-ның қанша жиынтығы болғанын анықтауға болады.
Инфекцияның ауырлығы олардың санының артуына тура пропорционал. Сондай-ақ вирустық жүктемені азайту үшін терапияның сәттілігін анықтауға болады.
ПТР биоматериалын жіберу
Сандық ПТР емханада негізінен таңертең жүргізіледі. Дәрігерге бару кезінде науқасқа не қабылдау керектігі айтылады: қырғыш, жағынды, зәр немесе қан. ПТР материалдың ластану деңгейіне қарамастан патогендерді анықтай алады.
Оң талдау үшін теорияда үлгілерде тек бір патогеннің болуы қажет. Іс жүзінде олар одан да қолайлы жағдай жасауға тырысады. Бұл үшін кейбір ұсыныстар бар:
- егер олар жыныс мүшелерінен қырғыш немесе тампон алсаоргандар, зерттеуге дейін үш күн бұрын интимдік қатынастан бас тарту керек;
- бактерияға қарсы препараттармен жууға немесе талдау алдында өзіңізді жууға болмайды;
- Зәр шығару түтігінен жағынды алудан үш сағат бұрын шыдамдылық танытып, ішектерді босатпау керек.
Қан тапсыру кезінде бұл ережелерді сақтамаңыз.
Сандық ПТР талдауының нәтижелері қалай түсіндіріледі?
Алынған нәтижелерді сандық бағалау
Бірқатар клиникалық жағдайларда емнің тиімділігі және/немесе патологиялық процестің динамикасы мәселесі пайда болады. Мұндай сұрақтар әсіресе созылмалы инфекциялармен ауыратын адамдарды (адамның иммун тапшылығы вирусы, В және С гепатиті) тексеру кезінде өзекті болып табылады. Диагноз қою кезінде олар ампликондардың (ПТР өнімдері) жинақталуы талданатын үлгіде қажетті геннің көшірмелерінің болуына пропорционалды екендігіне негізделеді.
Әрине, сандық ПТР нәтижелерін ескере отырып, арнайы ПТР сигналдарының қарқындылығын зерттеумен гельдік электрофорез арқылы жасалады. Сондай-ақ алынған нәтижелерді дұрыс сандық бағалаудың алғы шарты қажетті геннің белгілі көшірмелерін қамтитын оң сенімді бақылау үлгілері болып табылады (мысалы, бір ПТР реакциясы үшін С гепатиті генінің мың данасы). Сандық бақылаудың бірнеше сериялық сұйылтулары калибрлеу қисықтарын жасауға мүмкіндік береді және клиникалық үлгілердегі клиникалық генокопиялардың мазмұнын бағалау үшін пайдаланылады.
Сандық ПТР анықтамасында негізгі жетістік құру болдыРеакция қоспасына қарапайым праймерлермен бір уақытта қосылатын және ПТР процесін уақытында, яғни нақты уақыттағы ПТР бақылауға мүмкіндік беретін флуоресцентті ДНҚ зондтары.
TaqMan әдістемесі ампликонның ортаңғы бөлігіне тән және ұштарында екі белгісі бар флуоресцентті ДНҚ зондтарының синтезін білдіреді. Олардың бірі - флуоресцентті жапсырма, екіншісі - осы флуоресценцияға арналған сөндіруші молекула.
Флюориметр мен термоблок-күшейткіштің гибридті болып табылатын арнайы құрылғы әрбір пробиркадағы флуоресценцияны тұрақты өлшеуді жүзеге асырады (нақты уақыттағы ПТР принципі). ПТР 20-40 циклынан кейін әрбір үлгі үшін жеке қисық сызықтар алынады. Сынақ үлгісінде қамтылған қажетті геннің көшірмелерінің санын бақылау үлгілерімен калибрлеу қисықтарынан есептеуге болады.
Сонымен қатар, флуоресцентті әдіспен ПТР енгізудің маңызды ерекшелігі нәтижелерді есепке алу кезінде ПТР қоспасы бар түтіктерді ашудың қажеті жоқ. Бұл бөлменің күшейту өнімдерімен ластану мүмкіндігін азайтады және электрофорез үшін арнайы жұмыс аймақтарын бөлудің қажеті жоқ.
Сандық ПТР транскрипциясы нені көрсетеді?
Не ашылып жатыр?
Сандық ПТР сияқты әдіс арқылы гендердегі сапалық өзгерістер анықталады: кірістіру, жою және нүктелік мутация. Бірақ кейбір тұқым қуалайтын бұзылулармен сәйкес белгілер белгілі бір гендердің мазмұнының өзгеруіне жауап ретінде пайда болады.
РахметСандық талдау сандық нәтиже береді, көбінесе ХБ/мл. Бұл сынақ үлгісінің бір миллилитрінде халықаралық бірліктермен өлшенген қоздырғыштың РНҚ немесе ДНҚ көшірмелерінің белгілі бір саны табылғанын білдіреді.
Мөлшеріне байланысты инфекцияның ауырлығы диагнозы қойылады. Қан әдетте вирустық жүктемені анықтау үшін тексеріледі, өйткені ауру кезінде вирустар қанда еркін қозғалады.
Мүмкіндіктер
Қан сынауындағы сандық ПТР екі ерекшелігі бар.
- Талдау қалыптасқан ПТР өнімінің мазмұнын дәл анықтау үшін флуоресцентті немесе радиоактивті белгімен таңбаланған праймерлердің немесе дезоксирибонуклеозидтрифосфаттардың қатысуымен жүргізіледі.
- ПТР процесінде тым көп ПТР өнімдері пайда болғанға дейін реакцияны ертерек аяқтаңыз. Бұл қанығудың соңғы сатысында ПТР өнімдері көп болғанда, ферменттің өзі де, субстраттар да осы реакцияның шектеуші буындары ретінде әрекет етеді. Мұндай жағдайларда келесі ПТР циклінің аяқталуы бұдан былай ПТР өнімдері санының екі еселенуімен сипатталмайды, әртүрлі үлгілер арасындағы шамалы сандық айырмашылықтар теңестіріледі, олар реакция циклдерінің сериясынан өткеннен кейін ерте кезеңдерінде анық анықталған..
ПТР диагностикасының құны
ПТР зерттеуінің құны бар, ол қандай инфекция түрі тексерілетініне, талдау әдістемесіне және сынақ материалына байланысты. Бір инфекцияны анықтау үшін сіз іштей беруіңіз керек200-800 рубль. Сондай-ақ биоматериал алу ақысы қосылады - шамамен 400 рубль.
