Ағынды цитометрия – жасушаларды терең талдау үшін қолданылатын цитологиялық зерттеу әдісі. Оның артықшылығы әрбір ұяшықты жеке зерттеуге мүмкіндік береді. Талдаудың бұл түрі бірнеше секунд ішінде жүздеген ұяшықтардағы бірнеше параметрлерді бағалауға көмектеседі. Нәтижесінде цитофлюориметрия қазіргі уақытта ғалымдар мен клиницистерге қолжетімді талдаудың ең жылдам және дәл әдістерінің бірі болып саналады.
Принцип
Ағындық цитометрия принципі жасушалардың жарықтың шашырауын және люминесценциясын (флуоресценция) өлшеуге негізделген. Жасуша суспензиясы цитометрлік жасуша арқылы жоғары жылдамдықпен ағын түрінде өтеді, ол жерде лазермен сәулеленеді. Гидродинамикалық деп аталатын фокустау да сонда орындалады. Оның механизмі: зерттелетін бөлшектері бар ұяшықтан шығатын ағынның жылдамдығы жоғарырақ сыртқы ағынға ағуы. Нәтижесінде бөлшектер реттелген тізбекте тураланады.
Алдын ала жасушалар арнайы флуоресцентті бояғыштармен (фторхромдар) таңбаланады. Олардың арқасында лазер сәулесіқайталама жарқырауды қоздырады. Қабылданған жарық сигналдарын детекторлар тіркейді. Одан кейін ақпарат кейбір критерийлер бойынша ерекшеленетін жеке ұяшықтар популяцияларын санауға мүмкіндік беретін бағдарламалық қамтамасыз ету алгоритмдері арқылы өңделеді.
Кәдімгі микроскопиялық зерттеулер әртүрлі жасушаларды ажырата алмайды, себебі олар бірдей көрінеді. Цитофлюориметрия басқа деректерді (ДНҚ құрылымының тұтастығын) қамтамасыз ете алады, ақуыз экспрессиясын, жасуша тіршілігін талдай алады.
Фторхромдардың қозуы үшін әртүрлі толқын ұзындығы бар жарық сәулелері, сондай-ақ әртүрлі типтегі детекторлар қажет болғандықтан, қазіргі қондырғылар бірнеше анықтау арналарымен (4-тен 30-ға дейін) жабдықталған. Лазерлік эмитенттердің саны 1-ден 7-ге дейін болуы мүмкін. Неғұрлым күрделі құрылғылар бөлшектердің бірнеше қасиеттерін бірден көп параметрлі зерттеуге мүмкіндік береді.
Артықшылықтары мен кемшіліктері
Ағын цитометриясының артықшылықтарына мыналар жатады:
- жоғары өңдеу жылдамдығы (1 секундта 30 мыңға дейін оқиғаны тіркеу);
- көптеген ұяшықтарды зерттеу мүмкіндігі (үлгіде 100 миллионға дейін);
- Флуоресцентті жарықтың қарқындылығын анықтау;
- әр ұяшықты талдау;
- гетерогенді процестерді бір мезгілде зерттеу;
- жасушалық популяциялар бойынша деректерді автоматты түрде бөлу;
- нәтижелердің сапалы визуализациясы.
Бұл технологияның тағы бір ерекшелігі мынадаталданатын бөлшекті бірнеше флуоресцентті ерітінділермен бояуға болады. Осының арқасында көп параметрді зерттеу орын алады.
Кемшіліктерге техникалық жабдықтың күрделілігі және үлгіні арнайы дайындау қажеттілігі жатады.
Цитометрлер
Бұл түрдегі алғашқы құрылғылар Германияда 1968 жылы пайда болды, бірақ олар кейінірек кең тарады. Қазіргі уақытта ағынды цитометрия әдісімен жұмыс істейтін барлық құрылғыларды 2 түрге бөлуге болады:
- флуоресцентті сәулеленуді (екі немесе одан да көп толқын ұзындығы), 10° және 90° жарықтың шашырауын өлшейтін құрылғылар (төмен бұрыш және бүйірлік шашырау детекторы);
- бірнеше ұялы байланыс параметрлерін өлшеумен қатар, осы критерийлерге сәйкес топтарға автоматты түрде сұрыпталатын құрылғылар.
Алға шашырау детекторы жасуша өлшемін анықтауға арналған, ал бүйірлік шашырау құрылғысы жасушаішілік түйіршіктердің болуы, цитоплазма мен ядроның көлемдік қатынасы туралы ақпарат алуға мүмкіндік береді.
Классикалық цитометрлер, жарық микроскоптарынан айырмашылығы, жасушаның суретін алуға мүмкіндік бермейді. Дегенмен, соңғы жылдары микроскоп пен цитофлюориметрдің мүмкіндіктерін біріктіруге қабілетті құрама құрылғылар жасалды. Олар төменде талқыланады.
Бейнелеу цитометрлері
Классикалық ағын цитометриясында қолданылатын құралдар үшін,бір ерекшелігі тән: егер сирек кездесетін құбылыстар талданатын жасушалар популяциясында тіркелсе, олардың мәні неде екенін бағалау мүмкін емес. Бұл бөлшектер өлі жасушалардың қалдықтары немесе олардың сирек тобы болуы мүмкін. Кәдімгі құрылғыларда мұндай деректер оқиғалардың жалпы ағынынан шығарылады, бірақ ғылыми және клиникалық талдау үшін ерекше құндылық болуы мүмкін.
Бейнелеу ағынының цитометрлерінің жаңа буыны детектор аймағы арқылы ағында өтетін әрбір ұяшықтың суретін түсіруге мүмкіндік береді. Компьютер мониторында көрсетілетін диаграмманың сәйкес аймағын басу арқылы оны көру оңай.
Қолдану аймақтары
Ағынды цитометрия – медицина мен ғылымның көптеген салаларында қолданылатын әмбебап әдіс:
- иммунология;
- онкология;
- трансплантология (қызыл сүйек кемігін, дің жасушаларын трансплантациялау);
- гематология;
- токсикология;
- биохимия (клетка ішіндегі қышқылдықты өлшеу, басқа параметрлерді зерттеу);
- фармакология (жаңа препараттар жасау);
- микробиология;
- паразитология және вирусология;
- океанология (су объектілерінің жағдайын және басқа міндеттерді бағалау үшін фитопланктонды зерттеу);
- нанотехнология және микробөлшектерді талдау.
Иммунология
Адамның иммундық жүйесі алуан түрлі жасушалардан тұрады. Иммунологиядағы ағындық цитометрия олардың құрылымы мен қызметін бағалауға, яғни морфофункционалдық жүргізуге мүмкіндік береді.талдау.
Мұндай зерттеулер иммунитеттің күрделі табиғатын түсінуге көмектеседі. Жасушаның фенотиптері антигендермен белсендіру, патологиялардың дамуы және басқа факторлар нәтижесінде өзгереді. Цитофлюорометрия күрделі қоспадағы иммундық жасушалардың субпопуляцияларын бөліп, олардың уақыт бойынша барлық өзгерістерін бағалай алады.
Онкология
Онкологиядағы ең маңызды міндеттердің бірі жасушаларды түріне қарай дифференциациялау болып табылады. Онкогематологиядағы ағынды цитометрия арқылы талдау принципі келесі құбылысқа негізделген: үлгіні арнайы флуоресцентті бояумен өңдегенде ол цитоплазмалық ақуыздармен байланысады. Белсенді пролиферацияланатын жасушаларда бөлінгеннен кейін оның мазмұны екі есе азаяды. Сәйкесінше, жасуша люминесценциясының қарқындылығы екі есе азаяды.
Көбейетін жасушаларды анықтаудың басқа жолдары бар:
- ДНҚ байланыстыратын бояғыштарды қолдану (пропидий йодид);
- белгіленген урацилді қолдану;
- жасуша циклін реттеуге қатысатын циклин белоктарының экспрессиясының жоғарылау деңгейін тіркеу.
